A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋简述
历史背景：在此之前正首当其冲全球的新型冠状大肠杆菌疾 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个第三世界和北部大风靡一时，截至 2021 年 4 同年已赞剧最多 1.28 亿人疾菌，最多 280 万人丧命。局限开放性，尚待可必只需增高 COVID-19 感染率的外科手术工具。我们深入研究了一种传统意义的大豆本品本品——生发肺毒本品液 (RDS) 的潜在炎冠状大肠杆菌来时开放性，该本品液主要化学物质为东方疾理学传统意义里用以外科手术肺泡癌症的里肉桂。
结果：RDS 诱发 SARS-CoV 比较慢大肠杆菌、SARS-CoV-2 比较慢大肠杆菌、混杂亚型大肠杆菌-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型大肠杆菌以及传染开放性 SARS-CoV-2 和共有通的 Ha-CoV-2 变型大肠杆菌 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对诱导的疾菌。我们全面不可否认 RDS 可以并不只需要灭来时 SARS-CoV-2 大肠杆菌外层的传染开放性。此外，我们挖掘出有 RDS 还可堵托亚型甲型大肠杆菌对诱导的疾菌。
结论：RDS 可较广诱发溃疡大肠杆菌疾菌。页面：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状大肠杆菌，炎大肠杆菌外科手术，生发肺毒本品液，传统意义大豆，SARS-CoV，亚型甲型，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型大肠杆菌
▋历史背景
在此之前正首当其冲全球的新型冠状大肠杆菌疾 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个第三世界和北部大风靡一时，截至 2021 年 4 同年已赞剧最多 1.28 亿人疾菌，最多 280 万人丧命。局限开放性，尚待可必只需增高 COVID-19 感染率的外科手术工具。新经常出有现的 COVID-19 大肠杆菌疾原体为冠状大肠杆菌 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在致使急开放性换气综合征相关冠状大肠杆菌种类里的同在大肠杆菌[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 以前都是在里国挖掘出有的；SARS-CoV 大肠杆菌于 2002 年 11 同年在广东省首次被挖掘出有[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 同年在武汉首次被挖掘出有[1,7,8]。在里国，这两次由冠状大肠杆菌造成了的疫情里，大豆非常少被较广用到，用以紧急快速化学反应冠状大肠杆菌造成了的癌症。对于局限开放性的 COVID-19 大风靡一时，里国有最多 85% 的 SARS-CoV-2 疾菌病人接纳了传统意义里医药疗法（9，10）。许多用到的大豆究竟较强必只需的炎冠状大肠杆菌特开放性并在医学上究竟必只需，这个重要弊端尚未能给与充分答复。
大豆作为外科手术冠状大肠杆菌所引发癌症的必只需疗法，但由于欠缺母体或游离的系统深入研究，其发展与合理用到非常少受到了阻碍。为了明确大豆的潜在炎 SARS-CoV-2 来时开放性，我们从常用大豆里择优了多种肉桂变型开放性，并从大豆本品液 RDS(宾夕法尼亚州一种商业化开放性食品药品) 里挖掘出有了炎 SARS-CoV 和炎 SARS-CoV-2 大肠杆菌的来时开放性，一种在宾夕法尼亚州的商业化食品药品。RDS 用以请于强消化道换气系统的相比之下肥胖，其系数得注意多种肉桂化学物质，如大豆和荆芥，它们是传统意义上用以依靠换气道和肺泡癌症的里肉桂 (11-13)。在此，我们另据 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假大肠杆菌以及较强脑膜炎的野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌对诱导的疾菌较强诱发。我们全面证明 RDS 可通过并不只需要灭来时大肠杆菌外层或迫使大肠杆菌进逼而诱发大肠杆菌的一时期疾菌进度。此外，我们挖掘出有 RDS 还可以迫使丙流大肠杆菌对诱导的疾菌。这些相比之下，RDS 对溃疡大肠杆菌的疾菌可能较强较广的诱发。
▋结果
为了从传统意义里肉桂里只见到潜在的炎 SARS-CoV-2 来时开放性，我们从大约四十种传统意义肉桂里择优抽取出有 SARS-CoV-2S 细胞假型比较慢大肠杆菌[14,15] 和消化道肺泡 A549(ACE2) 诱导，此生物 ACE2 基因可能会通过比较慢大肠杆菌转导作为表征细胞内，从而稳定转导来构建极限表示。比较慢假型大肠杆菌用到绿色荧光细胞 (GFP) 或荧光以次酶 (Luc) 作为另据基因，并通过了较强广谱炎大肠杆菌进入诱发剂，以及拉伊多尔 (Arbidol)[16]，和生物炎毒血清对炎 SARS-CoV-2(平面图 1a、C) 的验证。我们必只需成功精确测量到拉伊多尔 (Arbidol) 和炎毒血清对于 SARS-CoV-2 假型大肠杆菌的诱发，这是我们在其他四十余种传统意义肉桂变型开放性检验里没有挖掘出有的，都有其里一些假定较高疗效的肉桂 (平面图 1a-C)。然而，鉴于比较慢开放性假型大肠杆菌非常少能精确测量 SARS-CoV-2 大肠杆菌的进逼犯罪行为，我们不用考虑这些肉桂变型开放性可能有在进入后阶段必只需诱发 SARS-CoV-2 的可能开放性。我们全面从传统意义抗生素生发肺毒本品液 (RDS) 里择优出有了可能的炎 SARS-CoV-2 来时开放性，该厂商所富含九种肉桂化学物质——、茎叶、大豆、荆芥、秦艽、苦杏仁、蜂房、皂角、杂色花，在里国传统意义上用以外科手术肺泡癌症 (11-13)。
所富含丙基咖啡豆硫、3，4-二邻咖啡豆酰基苯酚硫、丙基 3，4-二邻咖啡豆酰基苯酚硫、原儿茶硫、丙基绿原硫和木犀草以次；花蕾里还所富含酰 A、B 和 10 种系数得注意环烯醚天冬氨硫酰[17]；该变型还所富含皂有机硫有机硫 A 和 B，以及炎换气道作用的酰 C[18,19]。茎叶酯酰里所富含木脂以次、松脂酚茎叶酰[20]。大豆里所富含被称作大豆皂酰的甾体皂酰，是大豆属变型独有的变型化学物质[21,22]。细叶荆芥里主要来时开放性化学物质为四种单天冬氨硫，(−)-香草酮、(+)-纳罗伊酮、(−)-柠檬烯和 (+)-香草呋喃；这种变型还所富含其他化合物，如 1-辛烯-3-醇、3-辛酮、β-同年桂烯和β-酢浆草烯[23]。秦艽所富含最多 162 种化合物，都有环烯醚天冬氨硫和环烯醚天冬氨硫酰、苯丙酰、有机硫、天冬氨硫类、糖类、有机硫、和皂酰[24]。苦杏仁里所富含酚类、氰基化合物和果胶多糖[25]。皂角刺里所富含皂酰和羽扇豆硫[26,27]，而杂色花里所富含主要来时开放性化学物质杂色花硫[28]。为了全面检验 RDS 的炎 SARS-CoV-2 来时开放性，用不同挥发含量的 RDS 预西北侧理 A549(ACE2) 细胞核，然后让这些细胞核在假定 RDS 的前提接纳 4-6 全程的疾菌。疾菌后，在不假定 RDS 的前提培育细胞核，然后在 48 和 72 全程的时候，通过流式细胞核绝技对大肠杆菌疾菌的诱发来进行分析。为了依靠细胞核疗效，用到氯化丙啶 (PI) 对将可能会丧命和已丧命的细胞核来进行染色剂，非常少在来时细胞核群里分析 GFP+细胞核。如平面图 2 简述，我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假大肠杆菌较强副作用相关联诱发。为了确认这些结果，我们用到内源开放性表示 ACE2 的 VeroE6 细胞核重复使用了该疾菌科学实验。
(只见下页平面图)
ACE2 内部表示，生产开放性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 大肠杆菌可对其来进行疾菌，ACE2 通常用以冠状大肠杆菌的深入研究 (7)。顾及在欠缺 ACE2 极限表示 [15，29，30] 的前提，假型大肠杆菌对 VeroE6 的脑膜炎较低，我们还用到了荧光以次酶另据基因假型大肠杆菌，该大肠杆菌的另据基因表示由 HIV-1LTR 和 Tat 动力，较强很低的另据基因危险开放性和比特率。
平面图 2：RDS 诱发 SARS-CoV-2(GFP) 假型大肠杆菌疾菌 A549(ACE2) 细胞核。
A.A549(ACE2) 细胞核用 RDS 紧接著挥发 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型大肠杆菌疾菌。将细胞核浸去大肠杆菌和 RDS，并在不假定 RDS 的前提来进行培育。流式细胞核仪精确测量大肠杆菌疾菌诱发可能可能会。未能疾菌的细胞核和疾菌 SARS-CoV-2(GFP) 但擅自 RDS 外科手术的细胞核作为对应。GFP+细胞核倍数已说明了。(PI) 氯化丙啶。
B.RDS 的细胞核疗效定量分析。A549(ACE2) 细胞核用 RDS 紧接著挥发 4 全程，浸去 RDS，无 RDS 培育 48 全程。氯化丙啶染色剂深入深入研究正试图丧命细胞核和已丧命细胞核，流式细胞核绝技分析。手绘副作用-化学反应细胞核疗效圆弧，RDS 的半丧命含量 (LC50) 比率为 1:11.9。
如平面图 3A 简述，我们用到 Luc 报告基因假大肠杆菌和 VeroE6 细胞核来进行疾菌科学实验，捕捉到到 RDS 对该大肠杆菌疾菌较强副作用相关联诱发，并且半数诱发含量明确为 1:230RDS 挥发度 (平面图 3B)。我们还分析了 RDS 对 VeroE6 细胞核来时力的因以次，明确了 50% 细胞核丧命副作用为 1:11.8RDS 挥发度。
平面图 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假大肠杆菌和野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌的副作用相关联诱发诱发。用 RDS 紧接著挥发预西北侧理 A、BVeroE6 细胞核，可能会用 SARS-CoV-2(Luc) 假型大肠杆菌疾菌。将细胞核浸去大肠杆菌和 RDS，并在不假定 RDS 的前提来进行培育。在疾菌后 72 全程用荧光以次酶精确测量大肠杆菌疾菌的诱发。未能疾菌细胞核和 SARS-CoV-2-luc 疾菌但擅自过 RDS 外科手术的细胞核作为对应。科学实验重复使用三次。手绘副作用化学反应圆弧和 RDS 的 I-C50 挥发比率为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞核的细胞核疗效也通过氯化丙啶染色剂和流式细胞核绝技定量分析。用 RDS 紧接著挥发 4 全程，浸去 RDS，在不所含 RDS 的前提培育 72 全程。手绘细胞核疗效副作用-化学反应圆弧，RDS 的半丧命含量 (LC50) 比率为 1:13.8 挥发。DRDS 诱发传染开放性 SARS-CoV-2 疾菌。用紧接著挥发的 RDS 预西北侧理 VeroE6 细胞核，并在 RDS 假定的前提疾菌 SARS-CoV-2。疾菌 48 全程后，通过暴菌斑分析大肠杆菌释放后的大肠杆菌克隆诱发可能可能会。诱发次检验一式三份来进行，并在 Prism7(Graph Pad) 里用到单向期望系数 (One-Way ANOVA) 分析及 Dunnett 后检验 (Dunnett's Post Test)，以此明确统计数字显着开放性。明显开放性系数用星号对此如下：*p
为了全面验证用到假大肠杆菌获得的结果，我们检验了 RDS 对于 SARS-CoV-2 疾菌的堵托传染开放性并能。如平面图 3D 简述，RDS 同时也堵托了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞核的疾菌。RDS 在挥发 1:40 以上时可明显减低大肠杆菌斑块的过渡到。
综上，通过 SARS-CoV-2 假大肠杆菌与传染开放性大肠杆菌的相比之下，RDS 所富含诱发 SARS-CoV-2 疾菌的来时开放性化学物质，可能是通过并不只需要灭来时大肠杆菌或堵托大肠杆菌的一时期疾菌进度。
为全面深入研究可能的机制，我们将传染开放性 SARS-CoV-2 大肠杆菌外层与紧接著挥发的 RDS 在 37°C 下预培育 1 全程。随后，将组分全面由南向北挥发-(10–1 至 10–4)，并转为 Vero 细胞核来进行暴菌斑分析以明确大肠杆菌脑膜炎的增高。如平面图 4A 简述，我们捕捉到到在 RDS 里在此之后掩盖一全程后的大肠杆菌外层，其 SARS-CoV-2 的疾菌效价也呈副作用相关联下滑。该结果确认了 RDS 可必只需并不只需要灭来时 SARS-CoV-2 大肠杆菌外层的传染开放性。
我们全面检验了 RDS 究竟也能诱发 SARS-CoV-2 大肠杆菌变型的疾菌。为此，我们利用最近研发的混杂丙大肠杆菌-SARS-CoV-2 假型大肠杆菌 (Ha-CoV-2)[31] 来催化一系列 S 细胞系数得注意，都有英国系数得注意 (B.1.1.7)，赞比亚系数得注意 (B.1.351)，巴西系数得注意 (P.1)，赞利福尼亚州系数得注意 (B.1.429)，和其他几个新兴系数得注意 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和相关 S 细胞突变体在 37°C 紧接著挥发 RDS 培育 1 全程。随后，用该组分疾菌 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 诱导。疾菌后 12 全程，荧光以次酶精确测量大肠杆菌疾菌的诱发。如平面图 4B 简述，我们还捕捉到到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 细胞系数得注意的副作用相关联诱发。
我们还检验了 RDS 堵托 SARS-CoV 疾菌的并能，用到带有 SARS-CoV 突刺细胞的 GFP 另据基因比较慢大肠杆菌和[15] 伪副作用。我们将人 A549(ACE2) 细胞核用作诱导，将其用系列挥发的 RDS 预西北侧理，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因假大肠杆菌疾菌 4-6 全程。疾菌后在不所含 RDS 的前提培育细胞核，流式细胞核绝技分析精确测量其对大肠杆菌疾菌的诱发。值得注意，用到氯化丙啶考虑正试图丧命与已丧命的细胞核，非常少在来时细胞核群里分析 GFP+细胞核。如平面图 5A 简述，我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型大肠杆菌的诱发呈副作用相关联。我们全面确认了这些结果，并分析了 RDS 细胞内的诱发与 Luc 另据基因 SARS-CoV 假型大肠杆菌，SARSCoV(Luc)。我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的诱发呈副作用开放性贫乏，其半诱发含量 (IC50) 为 1:70.88 挥发度 (平面图 5B，C)。顾及 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都用到 ACE2 疾菌诱导，我们还检验了 RDS 的炎大肠杆菌来时开放性究竟非常少针对与 ACE2 有相互作用的冠状大肠杆菌。为此，我们精确测量了一种不相关的负链 RNA 大肠杆菌----亚型甲型大肠杆菌。它通过大肠杆菌血凝以次 (HA) 和细胞核α-唾液硫来疾菌诱导。为了催化亚型甲型大肠杆菌，将表示亚型甲型 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个片段的 8 个表征和一个 GFP-另据基因共有转染到 HEK293T 细胞核里。在 RDS 假定的前提，采集大肠杆菌外层可能会用以疾菌目标 MDCK 细胞核。如平面图 6A 简述，我们捕捉到到 RDS 对亚型甲型大肠杆菌的诱发呈副作用相关联。RDS 在 1:40 和 1:80 挥发时可完全堵托大肠杆菌疾菌，在 1:160 挥发时则可部份诱发亚型甲型。RDS 对 MDCK 细胞核的半丧命含量 (LC50) 经精确测量为 1:18.5(平面图 6B)。这些相比之下，RDS 的炎大肠杆菌来时开放性并非针对特定大肠杆菌，而可能必只需较广诱发多种溃疡大肠杆菌，如冠状大肠杆菌和亚型甲型大肠杆菌。
▋讨论
在本报告里，我们不可否认传统意义抗生素生发肺毒本品液 (RDS) 所富含广谱炎大肠杆菌来时开放性，可堵托 SARS-CoV、SARSCoV-2 和亚型甲型大肠杆菌的疾菌。虽然 RDS 必只需诱发多种大肠杆菌，但其炎大肠杆菌来时开放性因大肠杆菌类型和毒株而异。例如，对 SARS-CoV 比较慢假大肠杆菌的 I-C50 含量为 1:7.9 挥发度，对 SARS-CoV-2 比较慢假大肠杆菌的 I-C50 含量为 1:230 挥发度。对于传染开放性野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌，I-C50 为 1:40 挥发度，对亚型甲型，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其变型有不同的诱发，IC50 数系数从 1:70 到 1:2601 挥发度多达 (平面图 4B)。
(只见下一页平面图)
平面图 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和共有通的 Ha-CoV-2 变型较强副作用相关联灭来时作用。ASARS-CoV-2 外层赞紧接著挥发的 RDS 在 37°C 下培育 1 全程。随后，将组分全面紧接著挥发，并转为 Vero 细胞核里来进行暴菌斑分析，以明确大肠杆菌脑膜炎增高。诱发次检验一式三份来进行，并在 Prism7(GraphPad) 里用到单向期望系数 (One-WayANOVA) 分析和 Dunnett 后检验 (Dunnett'sPostTest) 以此明确统计数字显着开放性。明显开放性系数用星号对此如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和相关 S 细胞系数得注意与紧接著挥发的 RDS 在 37°C 培育 1 全程后，用组分疾菌 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 诱导。疾菌后 12 全程，荧光以次酶精确测量大肠杆菌疾菌的诱发。RDS 的 IC50 系数的挥发度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们全面不可否认 RDS 可以诱发冠状大肠杆菌的一时期疾菌进度。虽然具体的炎大肠杆菌机制尚未能似乎，但 RDS 可以通过并不只需要灭来时大肠杆菌外层或通过迫使大肠杆菌进逼或堵托大肠杆菌进逼后的一时期进度来迫使大肠杆菌疾菌。在其他几种传统意义大豆里也挖掘出有了炎 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的来时开放性。例如，一种常只见的传统意义大豆——杂色花。
杂色花根里已证明所富含杂色花硫以次，可诱发 SARS 大肠杆菌[32] 医学分离株的克隆。此外，另一种可用以外科手术溃疡癌症的大豆——双黄连本品，已说明了出有在游离以副作用相关联方式诱发 SARS-CoV-23CL 多糖 (3CLpro) 来时开放性。秦艽酰和秦艽以次拟作为双黄连堵托 3CLpro[33] 的必只需化学物质。
平面图 5 RDS 诱发 SARS-CoV 假型大肠杆菌对 A549(ACE2) 细胞核的疾菌。用紧接著挥发的 RDS 预西北侧理 A、B 细胞核，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型大肠杆菌疾菌。将细胞核清浸，去掉大肠杆菌和 RDS，在不假定 RDS 的前提来进行培育。在疾菌后 48 全程和 72 全程，通过流式细胞核绝技或荧光以次酶精确测量来定量分析大肠杆菌疾菌的诱发。科学实验重复使用三次。手绘副作用叛离圆弧，并手绘 RDS 的 IC50 系数为 1:70.9 挥发度 (C)
平面图 6 RDS 诱发丙流大肠杆菌对 MDCK 细胞核的疾菌。(A) 用紧接著挥发的 RDS 预西北侧理 MDCK 细胞核 30 分钟，然后用丙流大肠杆菌 (GFP) 对其来进行疾菌。疾菌后，在 RDS 假定下培育细胞核。36 全程后用流式细胞核仪对大肠杆菌疾菌的诱发来进行定量分析。把未能疾菌的细胞核与被丙流大肠杆菌 (GFP) 疾菌但擅自 RDS 西北侧理的细胞核来进行对比。平面图里说明了了 GFP+细胞核的倍数。PI 对此氯化丙啶 PI。
(B) 另外还用到了 MTT 分型定量分析了 RDS 对 MDCK 细胞核的疗效，手绘了细胞核疗效的副作用-化学反应圆弧，经数系数，RDS 的半数丧命含量为 1:18.5 挥发度 RDS 的必只需炎大肠杆菌化学物质尚未能明确。然而，RDS 不同于秦艽酰和秦艽以次，RDS 可以通过并不只需要灭来时大肠杆菌粒子来堵托大肠杆菌疾菌 (平面图 4)，而秦艽酰和秦艽以次则在大肠杆菌生命周期的后期通过堵托大肠杆菌多糖的来时开放性来无论如何。然而，RDS 的游离炎 SARS-CoV-2 来时开放性仍只需在今后的动物深入研究和生物医学次检验里给与确认。在此之前，我们正试图来进行小型动物科学实验，以明确 RDS 在母体堵托 SARS-CoV-2 大肠杆菌疾菌的潜力。
▋结论
我们的深入研究表明，RDS 可较广诱发溃疡大肠杆菌的疾菌，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和亚型甲型。
▋工具
细胞核和细胞核培育
HEK293T (ATCC 博拉维斯，新泽西州) MDCK (ATCC 博拉维斯，新泽西州)，VeroE6 (ATCC 博拉维斯，新泽西州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 获赠，博拉维斯，新泽西州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 获赠，博拉维斯，新泽西州) 在此之前完好于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔生物技绝技 Thermo Fisher Scientific) 所富含 10% 热灭来时 FBS 和 1×青霉以次-链霉以次 (赛默飞世尔生物技绝技 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞核培育基里分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的含量转为嘌呤霉以次和潮霉以次 B。
原核生物转染和大肠杆菌催化
所含 SARS-CoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的比较慢开放性假型大肠杆菌外层由 Virongy LLC (Manassas，VA) 备有，或按照前面详细描述的工具[15] 催化。简言之，为了催化 GFP 另据基因比较慢开放性假大肠杆菌，HEK293T 细胞核与表示 SARS-CoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的表征、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共有转染。为了产出有荧光以次酶另据基因比较慢开放性假型大肠杆菌，将 HEK293T 细胞核与表示 SARSCoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的表征、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 来进行共有转染。转染后 48 全程采集大肠杆菌上清液，离心浓缩，−80℃ 完好。野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 备有。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因原核生物和 A/WSN/1933 H1N1 共有通原核生物 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 博士友善备有。在甲型大肠杆菌 A-GFP 另据基因粒子催化里，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共有转染 HEK293T 细胞核 (ΔAT6)。48 全程后采集大肠杆菌上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 表示表征美国进口 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 还原了 Ha-CoV-2(Luc) 表征和 S 细胞突变表征。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 细胞突变粒子按照前面详细描述工具[31] 来进行催化。
大肠杆菌疾菌和抗生素诱发次检验
RDS(生发肺毒本品液)(来自 Dejia Harmony 获赠，利斯堡，新泽西州) 是由马博士Laboratory (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种商业化厂商。RDS 里所有里肉桂化学物质非常少符合《里国修订本 2015 年版》「饮片」标准，都有必只需化学物质纯度及硬核、农药限量精确测量。RDS 是一种大豆的共有煎剂，就此游离在汽化前提下蒸发。SARS-CoV-2 炎血清由 LanceA. Liotta 医生备有。将拉伊朵尔盐硫盐 (Sigma) 重新悬浮在苯酚 (Sigma) 里。对于假型大肠杆菌疾菌，12 孔板里的 A549(ACE2) 细胞核 (来自 Virongy LLC 获赠，博拉维斯，新泽西州) 或 VeroE6 细胞核用 RDS 预西北侧理 30 分钟，在 37℃ 下疾菌 4-6 全程，然后在美味培育基里浸涤培育 48-72 全程。对于 VeroE6 细胞核的疾菌，细胞核也被 CoV-2 假型大肠杆菌疾菌请于强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 获赠，博拉维斯，新泽西州) 预西北侧理后，在 37°C 下于是又西北侧理 30 分钟。用到 GloMaxDiscover 酶标仪 (Promega) 分析细胞核裂解物的荧光以次酶来时开放性。对于野生型 SARS-CoV-2 疾菌，VeroE6 细胞核在 37°C 下用 RDS 预西北侧理 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 疾菌 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在爱德华布洛克大学的 BSL-3 收容军事设施内停留 1 全程。细胞核用 PBS 浸涤 2 次，用所含 RDS 的培育基培育 48 全程。从上清里抽取大肠杆菌，用 12 孔板培育的 Vero 细胞核单层里的暴菌斑次检验精确测量小瓶滴度。简言之，每个样本在值得注意的 Dul-becco's ModifiedEagle 培育基 (VWR) 里催化，系数得注意 1X 青霉以次-链霉以次 (VWR)，并附赞 10% 的 FBS(赛默飞世尔生物技绝技 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种挥发液蜜附到 VeroE6 细胞核单层的三个平行孔上 1 全程。然后用 1～2 ml0.6% 罗济夫糖 (Invitrogen) 和一部份值得注意的 Eagle Minimal Essential 培育基 (VWR) 的组分延展单层，所含 1X 青霉以次-链霉以次，并附赞 10%FBS。48 全程后，将单层膜固定在 10% 丙醛氢氧化钠里 1 全程，并去除延展的罗济夫托。为了染色剂斑块，转为所富含 20% 丙酮的 1% 结晶杂色染色剂氢氧化钠 5 分钟，然后用去离子水浸涤。对于亚型甲型大肠杆菌疾菌 MDCK 细胞核，在 37°C 下用 RDS 预西北侧理 30 分钟，然后用 A-GFP 另据基因大肠杆菌疾菌 6 全程。用所含 RDS 的培育基浸涤细胞核，培育 36 全程。GFP 表示通过流式细胞核仪定量分析。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 大肠杆菌外层的 RDS 灭来时次检验，将 100μl 紧接著挥发的 RDS 附赞到 1 mlSARS-CoV-2 大肠杆菌原液 (3.65×105PFU/ml) 里，就此 RDS 挥发为 1:20，1:40 或 1:80。也都有对应前提 (1 ml 大肠杆菌+100μl 培育基)。组分在 37°C 下培育 1 全程。随后，对组分来进行系列挥发以消除额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 挥发度，并将紧接著挥发的样本转为 12 孔板里的 Vero 细胞核里，用以来进行暴菌斑精确测量量分析化。斑块精确测量里就此的 RDS 挥发度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 挥发液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 细胞突变粒子按照前面详细描述的工具[31] 催化。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭来时，将 5μl 紧接著挥发的 RDS 附赞到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或系数得注意里，就此 RDS 挥发度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将组分在 37°C 下培育 1 全程，然后在 RDS 假定下疾菌 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞核 12 全程。用到 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 分析细胞核裂解物的荧光以次酶来时开放性。
细胞核疗效分析精确测量
用氯化丙啶染色剂和流式细胞核绝技分析对 A549 (ACE2) 细胞核和 VeroE6 细胞核的抗生素细胞核疗效来进行精确测量，如所述 (34)。用到细胞核请于殖氢化盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商建议的方案对 MDCK 细胞核的抗生素疗效来进行分析。简言之，将 MDCK 细胞核 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞核的速度接种到 12 孔板里。细胞核培育隔夜后，通过 RDS 西北侧理 1 天，然后在 MTT 上面氢化 (Sigma) 的培育基里培育。将细胞核与上面氢化共有同培育 4 全程，于是又后续转为 MTT 请于氢氧化钠。培育皿孵育过夜，用 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 精确测量蜜视星等。
缩写
SARS-CoV：致使急开放性换气系统癫痫相关冠状大肠杆菌；SARSCoV-2：Severe 致使急开放性换气系统癫痫相关冠状大肠杆菌-2；TCM：传统意义大豆；RDS：溃疡使用人本品液；Ha-CoV-2：混杂亚型新冠大肠杆菌假大肠杆菌。
致谢
感恩 FengLi 备有甲型大肠杆菌表示表征，感恩 LanceLiotta 备有炎毒血清；感恩 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的讨论与建议；感恩 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 备有 RDS 和肉桂变型开放性。
原作者贡献
此次科学实验由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 主笔，由 L.A.H. 校对。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 拒绝执行了该科学实验。所有原作者已写作并审批就此稿件。
资金
本深入研究的经费来自于爱德华布洛克大学内部资助 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该赔偿金由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 备有。
数据资料和材料的可用开放性
本深入研究里消除或分析的所有数据资料非常少系数得注意在本文里。氢化可从 Y.W 西北侧获取。
回应
审批及参与决定
不受限制
决定出有版社
不受限制
竞争私利
爱德华布洛克大学第三世界生物部署和传染疾里心的 RMH 和 YW 已获得了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的深入研究资助，LAH 为德佳和畅担任顾问并获得了酬金。没有其他关系或来时动可能因以次到审批的工作。
原作者指明
1宾夕法尼亚州新泽西州爱德华布洛克大学神经科学学院第三世界生物部署和传染疾里心，博拉维斯 20110。
2VirongyLLC，新泽西州博拉维斯。3赞拿大伯纳比，BCV5J0E5 马博士Laboratory (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 宾夕法尼亚州新泽西州利斯堡世界卫生科学组织，20176。
收稿迟于：2021 年 4 同年 7 日
接纳迟于：2021 年 5 同年 10 日
线上出有版社时间：2021 年 5 同年 29 日
以下内容
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校对： 翟极限男相关新闻
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